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      免疫組化染色技術中常見問題、原因分析及解決方案

      發布時間:2013-3-18 14:26:16

      常見問題 原因分析 解決方案
      染色陰性 陽性對照染色成立,受測組織染色陰性。 受測組織中沒有受測抗原。 按染色陰性結果處理,無需重復實驗。
      陽性對照染色不成立,受測組織染色陰性。 抗原修復操作不當。如:①建議無需抗原修復,實際操作卻進行抗原熱修復(如邁新編號RAB-0090,HBcAg);②建議進行抗原酶消化修復,實際操作卻進行抗原熱修復或不修復(如邁新編號MAB-0280,MOC31)。 按照一抗說明書中建議的抗原修復方式,進行正確的抗原修復操作。
      一抗與二抗檢測系統種屬匹配性錯誤。 根據一抗的種屬正確選擇匹配性的二抗檢測系統。如受測組織為人體標本時,一抗為鼠抗,則二抗檢測系統選擇抗鼠或抗鼠/兔;一抗為兔抗,則二抗檢測系統選擇抗兔或抗鼠/兔。
      實驗操作中出現錯誤。如漏加某一試劑或試劑滴加順序錯誤。 嚴格按照試劑說明書中建議的實驗方法進行實驗。
      對于濃縮試劑而言,可能使用了不合格的稀釋劑。一抗稀釋劑偏酸時,會影響一抗與抗原的結合能力;二抗檢測系統稀釋劑中若含有疊氮鈉等防腐劑時會影響二抗檢測系統與一抗的結合能力。 使用合格的濃縮試劑稀釋劑。
      一抗選擇錯誤,選用了只能用于冰凍組織而不能用于石蠟包埋組織的一抗。 選擇能用于石蠟包埋組織的一抗。
      一抗、二抗檢測系統、顯色試劑被污染,失效或已超過有效期。 使用無污染,在有效期內且性能良好的試劑進行實驗。
      二抗檢測系統與顯色試劑不匹配。 根據二抗檢測系統的種類,選擇相應的顯色試劑。如辣根過氧化物酶二抗檢測系統可選擇DAB、AEC顯色試劑;堿性磷酸酶二抗檢測系統可選擇BCIP/NBT、AP/Red顯色試劑等。
      抗原含量過低。 使用放大效應更高的二抗檢測系統進行實驗。
      試劑濃度過低、過高或不合適的孵育時間和溫度。 選擇濃度合適的試劑,按照說明書中建議的孵育方式進行實驗。
      水溶性色原顯色后使用了含醇的復染液或用乙醇脫水、二甲苯透明(如AEC、BCIP/NBT、AP-Red等顯色試劑)。 重新染色,并使用水溶性的復染液和封片劑。
      染色弱 陽性對照染色成立,受測組織染色弱。 固定液使用不當,破壞了標本組織中的抗原。 查看一抗說明書或相關文獻,使用推薦的固定液(如10%中性緩沖福爾馬林固定液等)。
      組織經固定和包埋等處理后抗原被破壞。 新鮮組織及時固定,防止其自溶;選擇合適的固定液,固定時間應符合要求;使用低熔點的軟蠟(58℃左右)包埋,包埋溫度不超過60℃。
      烤片溫度過高或時間過長。 烤片溫度以高于用于包埋的石蠟熔點3-5℃(或65-70℃)為適,烤片時間為1-2h。
      受測組織中抗原含量低。 使用放大效應更高的二抗檢測系統進行實驗。
      陽性對照和受測組織均為染色弱。 抗原修復方式不正確或遺漏。如修復時間、溫度,修復液的pH值沒有達到要求或要求進行抗原修復的卻沒有進行抗原修復等。 按照一抗說明書中建議的抗原修復方式進行抗原修復。修復過程要正確:修復溫度,時間要達到要求,修復液選擇恰當。
      過氧化物酶阻斷試劑阻斷或血清封閉時間過長,試劑濃度不合適。 使用市售的即用型試劑并按照說明書中建議的孵育方式進行實驗。
      一抗、二抗檢測系統、顯色試劑濃度過高、過低或孵育時間過短。 調整試劑濃度或使用市售即用型試劑并按照說明書中建議的孵育方式進行實驗。
      使用已超過有效期的試劑。 使用有效期內性能良好的試劑進行實驗。
      孵育溫度太低(低于15℃)。 延長孵育時間;或在37℃溫箱內孵育,但應縮短孵育時間(30min)。
      滴加試劑時,組織上的緩沖液(或血清)殘留過多,導致試劑滴加后被稀釋。 每次滴加試劑前將組織上的緩沖液(或血清)除去,但應防止組織干燥。
      復染液復染過度。 復染時以細胞核淡染為適(不同類型蘇木素配方不同,染色時間也不同,需優化染色時間)。
      重復使用抗原修復液(可能導致修復液的pH值發生改變或夾雜雜質,進而影響抗原修復效果)。 每次使用新鮮配制的抗原修復液,并將其pH值調整至要求范圍內。
      顯色試劑孵育時間過短或試劑配制錯誤(如配制DAB時,過氧化氫濃度不適或色原的量添加過量等)。 配制顯色試劑時嚴格按照說明書中建議的使用方法執行;條件允許的話最好在顯微鏡下觀察控制顯色時間。
      陽性對照染色成立,受測組織出現“陰陽臉”著色。 滴加試劑時,試劑未完全覆蓋組織。 每次滴加試劑后,仔細檢查一遍,確保試劑將組織完全覆蓋。
      實驗操作臺面不平或孵育盒不平,導致切片有個傾斜度,試劑滴加后將流向水平面低的一邊,造成另一邊的組織未被試劑覆蓋或試劑很少,導致最終染色成“陰陽臉”結果。 實驗時確保實驗臺面和孵育盒是水平的。
      滴加試劑到組織上時存在氣泡,卻沒有將氣泡除去。 滴加試劑后再仔細檢查一遍,若發現有氣泡存在,務必將氣泡除去。
      組織固定時間過短,造成組織中心部位固定不足。 組織固定時間應達到標準要求。
      背景染色 對照組織和受測組織,或在一些組織成分如脂肪、結締組織和上皮組織中有背景染色。 切片脫蠟不徹底。 使用新鮮的二甲苯或其替代品進行脫蠟。
      抗原修復過度。 嚴格控制抗原修復時間,溫度;按照一抗說明書中建議的抗原修復方式執行或摸索出更適合自身實驗室的抗原修復方式。
      一抗濃度過高、孵育時間過長或孵育溫度過高。 降低一抗濃度,縮短孵育時間,控制孵育溫度。一抗孵育環境一般為:室溫1h、4℃過夜或37℃30min(可根據實驗室自身情況作相應調整)。
      二抗檢測系統濃度過高、孵育時間過長或孵育溫度過高。 降低試劑濃度,按照試劑說明書中建議的孵育方式進行實驗。
      顯色試劑孵育時間過長。 縮短顯色試劑孵育時間,最好能在顯微鏡下觀察控制顯色時間。
      PBS緩沖液重復使用多次或玻片沖洗不足。 每次使用新鮮的PBS緩沖液,玻片沖洗一定要充分,可在緩沖液中添加0.025-0.05%的Tween-20。
      使用錯誤的封閉血清。 封閉血清一般與二抗檢測系統種屬相同,或者使用無血清蛋白封閉,但是不能選擇與一抗種屬相同的血清。
      載玻片中粘附劑過厚。 重新配制粘附劑,制作新的防脫玻片。
      受測組織和陰性試劑對照出現背景染色,而陽性和陰性組織對照染色成立。 組織固定不及時,造成部分抗原彌散并遺留在組織內。 組織及時固定。
      取材時,由于使用鈍的刀片,導致組織受到人為擠壓而變形,血清蛋白彌散并遺留在組織內。 使用鋒利的刀片取材。
      受測組織有部分壞死、損傷或壓迫成分。 觀察染色結果時忽略此物理性損傷部分或重新取材。
      組織切片太厚。 福爾馬林固定、石蠟包埋的組織切片厚度一般為3-5μm,冰凍切片不超過10μm。
      陰性試劑對照不成立,而陽性、陰性組織對照和受測組織染色成立。 陰性對照血清濃度不合適。 使用濃度合適的陰性對照血清。對于單克隆抗體,陰性對照血清濃度稀釋至其Ig含量與一抗相近;而對于多克隆抗體,則稀釋至其蛋白含量與一抗相近。
      陰性對照血清被污染并與受測組織中的蛋白發生交叉反應。 使用無污染的陰性對照血清進行實驗。
      對照染色成立,受測組織出現灶狀背景染色。 裱片時水未排盡,在局部形成氣泡使組織突起;實驗過程中試劑滴加時滲入此區域后不易沖洗干凈,導致染色過深。 裱片時務必將水排盡。
      用于裱片的水浴鍋中的水質被細菌或酵母菌等污染。 定期清潔水浴鍋并保證每次使用干凈的水。
      制作APES防脫玻片時,APES的濃度過高,干燥后在玻片上留下白色小點,顯色時白色小點著色。 嚴格按照試劑說明書中建議的使用方法制備防脫玻片。
      組織切片有皺褶、撕裂、刀痕等,造成實驗過程中試劑沒有被徹底沖洗干凈,進而導致染色過深。 確保受測組織切片完整,不出現皺褶、撕裂、刀痕等。
      對照染色成立,受測組織出現邊緣效應。 組織邊緣與玻片黏貼不牢,經抗原熱修復或后續緩沖液沖洗后,造成邊緣組織松脫浮在玻片上方,每次沖洗時不易將組織下面的試劑洗凈,進而導致此區域染色過深。 組織前期處理(特別是脫水環節)應規范,切片厚度適中,使用防脫性能良好的玻片,沖洗時不要對著組織沖洗。
      滴加試劑時,試劑未充分覆蓋組織,導致組織邊緣無試劑或試劑很少,孵育時此區域容易首先變干,造成濃度較中心組織高而導致染色過深。 每次滴加試劑時務必使試劑充分覆蓋組織(可在滴加試劑前在離組織邊緣3mm處用免疫組化油筆畫圈)。
      對照染色成立,受測組織出現非特異的細胞核著色。 組織前期處理不適當,如組織在二甲苯中浸泡時間過長,固定液使用不當;組織變干,抗原修復液的pH值和修復時間不當或修復過程中修復液蒸發過多,造成最后部分組織沒有浸泡在修復液中。 嚴格按照標準操作規程進行操作。
      使用生物素二抗檢測系統時,組織中內源性生物素顯色。 這種非特異性顯色通常發生在高代謝器官組織中,當組織切片進行抗原熱修復后,組織中所含的內源性生物素同生物素二抗檢測系統中的鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶發生鏈接而造成非特異性顯色,顯色多定位于胞漿中,且迷惑性極大。 使用內源性生物素阻斷試劑進行阻斷;或者使用非生物素二抗檢測系統,如邁新的MaxVisionTM、MaxVisionTM?2、EliVisionTM?plus、EliVisionTM?Super。
      使用辣根過氧化物酶二抗檢測系統時,組織中內源性過氧化物酶顯色。 這種顯色通常發生在紅細胞、壞死組織、炎癥細胞中。是由于組織中所含的過氧化物酶沒有用相應阻斷試劑阻斷或阻斷不完全。 使用過氧化物酶阻斷試劑阻斷,適當延長阻斷時間;或者使用堿性磷酸酶二抗檢測系統。
      組織脫片 組織處理和蠟塊選擇不當。 按照《臨床技術操作規范?病理學分冊》進行組織處理,脫水徹底,盡量不選擇脂肪多的組織。?
      載玻片防脫功能差。? 使用防脫功能好的載玻片。
      抗原修復不正確,如修復過度或修復結束后迅速冷卻等。? 按照一抗說明書中建議的抗原修復方式,進行正確的抗原修復操作。?
      組織切片太厚、不均勻、皺褶等。? 組織切片厚度為3-5μm,切片完整,均勻,無皺褶等。?
      烤片條件:溫度過低、時間過短等。? 烤片溫度以高于用于包埋的石蠟熔點3-5℃(或65-70℃)為適,烤片時間為1-2h。
      沖洗方式不正確,如對著組織沖洗。? 掌握正確的沖洗方式。?